内源性氨基酸偶联和二硫键重建策略
内源性氨基酸偶联
最常见的偶联方法之一是使用抗体的赖氨酸残基（氨基酸亲核NH2基团）与接头有效载荷上的亲电N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团反应。虽然反应简单，但赖氨酸残基的高丰度导致在随机分布下形成许多ADC的不均匀混合物。DAR通过抗体-药物偶联物的化学计量控制，这种策略被广泛使用，包括已获批的ADC如Besponsa、Mylotarg和Kadcyla。
二硫键重建策略
IgG抗体包含四条链间二硫键，两条连接轻链和重链，另外两条位于连接两条重链的铰链区域。它们维持单克隆抗体的完整性。另一种经典的生物偶联途径探索了这些半胱氨酸作为有效载荷附着点的作用。四个二硫键的还原通常产生八个巯基，它们可以与马来酰亚胺的接头反应，产生DAR=8的ADC。
Dorona及其同事报道了一个ADC示例，该ADC包含与MMAE偶联的嵌合抗CD30单克隆抗体，DAR=8。与经典的赖氨酸偶联相比，这种有效载荷加载方法更易控制。然而，据报道其血浆清除率更高，同时血浆聚集风险降低。
2015年，chudasama等人引入了一种新型重建试剂——二溴哒嗪二酮。他们证明该试剂能有效插入二硫键，所得结构即使在高温下也表现出优异的水解稳定性。然而，随着还原步骤温度的升高，也观察到异质性，并且该结构还允许选择性地引入不同的官能团。
二乙烯基嘧啶是另一种有效的重建试剂，可产生DAR=4的稳定ADC。Spring等人研究了乙烯基杂芳基骨架对半胱氨酸重建的影响。他们认为用嘧啶取代吡啶可使杂芳环成为更好的电子受体，从而提高交联效率。他们的工作扩展到二乙烯基三嗪，在高温下显示出更高的效率。
为了避免经典马来酰亚胺偶联相关的体内不稳定性缺点，Barbas等人研究了甲基磺酰基苯基噁二唑，该化合物对半胱氨酸具有特异性反应。它们在血浆中比半胱氨酸-马来酰亚胺偶联物更稳定。受此启发，Zeglis设计了dipods试剂，它包含两个通过苯环连接的噁二唑甲基砜部分。Dipods以重建的方式与两个硫酸根形成共价键。与马来酰亚胺偶联相比，这种方式的偶联在体外稳定性和体内性能方面均具有优势。
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